Исследование ликвора, спинномозговой жидкости – один из самых распространенных анализов, который с успехом применяют для выявления наличия разнообразных неврологических заболеваний.
Реакция Панди – метод исследования ликвора, который впервые применил венгерский невропатолог и специалист по психическим заболеваниям Кальман Панди в 1910 году. С тех пор он стал широко применяться в медицине, так как позволяет точно и достоверно выявить наличие патологических процессов в спинном или головном мозге.
Особенности методики
Реакция Панди – метод исследования, который позволяет определить повышенный уровень глобулинов (белков) в спинномозговой жидкости.
В качестве химического реактива используется карболовая кислота. При контакте карболовой кислоты и ликвора образуются участки помутнения, при этом интенсивность помутнения напрямую зависит от количества белков, присутствующих в спинномозговой жидкости.
В норме человеческий ликвор прозрачен. Помутнение спинномозговой жидкости возникает при увеличении в нем концентрации лейкоцитов, глобулинов, эритроцитов, наличии различных микроорганизмов. Повышенная концентрация этих элементов свидетельствует о воспалительных процессах, патологиях головного или спинного мозга, сосудистых нарушениях.
Проведение исследования и интерпретация результатов
В результате люмбальной пункции производится забор спинномозговой жидкости, служащей исходном материалом для проведения реакции.
Для исследования используют вогнутое стекло, под которое подкладывают черную бумагу. В качестве реактива применяют раствор карболовой кислоты, приготовленный в следующей пропорции: 1 часть кристаллизованной карболовой кислоты к 15 частям дистиллированной воды.
В центральную часть предметного стекла капают 1 мл. концентрированной карболовой кислоты, в центр или по краям реактива наносят каплю ликвора. Возможно нанесение 2 капель ликвора, но при этом важно соблюдать пропорцию 1 капля спинномозговой жидкости: 1 мл. раствора.
Если реакция Панди в ликворе положительная, то в местах соприкосновения двух жидкостей образуется участок помутнения, интенсивность которого зависит от количества белков в спинномозговой жидкости.
Степень выраженности реакции интерпретируется с помощью крестов. Так, один крест «1+» означает слабую опалесценцию и является либо вариантом нормы, либо свидетельствует о незначительном содержании глобулинов в ликворе (немного более 0,2 г/л).
Результат «2+» — заметная опалесценция, а «3+» — умеренное помутнение. «4+» означает сильное помутнение, что свидетельствует о значительном повышении количества глобулинов в спинномозговой жидкости.
Проба Панди сродни реакции Нонне-Апельта, с той лишь разницей, что для проведения реакции Панди необходимо меньшее количество ликвора.
О чем свидетельствует положительный отклик
Повышенный уровень глобулинов в ликворе может являться следствием гнойного, туберкулезного либо , свидетельствовать о недавно проведенных операциях на мозге, абсцессе или . При этом чем больше «крестов» наблюдается по результатам пробы, тем изменения, нарушения в спинном или головном мозге более выражены.
При наличии в ликворе примесей крови проба Панди всегда будет положительной. Именно поэтому положительная реакция наблюдается при , нарушениях гемодинамики в сосудистой системе.
Нарушение гемодинамики приводит к тому, что стенки сосудов становятся легко проницаемыми и плазма крови с белковой составляющей поступает в ликвор. Наблюдается положительная проба Панди.
Реакция Панди – качественная проба, которая свидетельствует о наличии повышенной концентрации белка в ликворе. Для уточнения диагноза и более четкого определения количества глобулинов в крови используют другие более информативные и современные методы исследования.
119. Реакции Панди и Нонне - Апельта
В качестве реактива для проведения реакции Панди используют надосадочную прозрачную жидкость, которую получают при сильном взбалтывании 100 г жидкой карболовой кислоты с 1000 мл дистиллированной воды. Для получения осадка и прозрачной жидкости (реактива) данную смесь помещают сначала на 3-4 ч в термостат, а затем 2-3 дня выдерживают при комнатной температуре.
Часовое или предметное стекло кладут на темную бумагу и наносят на него 2-3 капли реактива, затем 1 каплю спинномозговой жидкости. При помутнении капли или появлении нитевидной мути по ее периферии реакцию считают положительной.
Для проведения реакции Нонне - Апельта необходимы чистые пробирки, насыщенный раствор аммония сульфата, дистиллированная вода, темная бумага. Насыщенный раствор аммония сульфата готовят следующим образом: в колбу емкостью 1000 мл помещают 0,5 г химически чистого нейтрального аммония сульфата, затем наливают 100 мл дистиллированной воды, подогретой до 95 °С, взбалтывают до полного растворения соли и оставляют на несколько дней при комнатной температуре. Спустя 2-3 дня раствор фильтруют и определяют рН. Реакция должна быть нейтральной.
В пробирку наливают 0,5-1 мл полученного раствора и осторожно по стенке пробирки добавляют такое же количество спинномозговой жидкости. Через 3 мин оценивают результат. Появление беловатого кольца свидетельствует о положительной реакции. Затем содержимое пробирки взбалтывают, определяют степень помутнения, сравнивая с пробиркой, содержащей дистиллированную воду. Результаты реакции оценивают на фоне черной бумаги.
120. Реакция Борде - Жангу
Ценный диагностический тест при выявлении хронической гонореи среди лиц, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями мочеполовой системы. По данным литературы, при правильном использовании этого метода выявляют до 80 % случаев гонореи, не обнаруженной бактериоскопическим или бактериологическим методом.
Реакция Борде - Жангу может быть следовой в результате перенесенного ранее заболевания или применения гоновакцины с диагностической (иммунобиологический метод провокации), а также лечебной (лечение хронических воспалительных процессов мочеполовой системы у женщин по Бакшееву) целью. Поэтому перед ее проведением необходимо тщательно собрать анамнез,
Реакция может быть и ложноположительной при введении молока, использовании в лечебных целях пирогенала.
Следовательно, положительная реакция Борде - Жангу не служит бесспорным доказательством наличия гонококковой инфекции, как и отрицательная не может быть свидетельством отсутствия гонореи. Однако положительные результаты ее в течение длительного времени должны нацелить врача на поиск очага гонококковой инфекции в организме.
В качестве антигена используют убитую гонококковую культуру, содержащую 3-4 млрд. микробных тел в 1 мл. Гонококковый антиген консервируют раствором формальдегида и разливают в ампулы по 1- 5 мл. Не вскрытые ампулы пригодны в течение 6 мес, вскрытые можно сохранять 2-3 дня в стерильной пробирке в холодильной камере при температуре 3-5 °С,
Реакцию связывания комплемента Борде - Жангу проводят аналогично реакции Вассермана (см. № 121). Гонококковый антиген разводят изотоническим раствором натрия хлорида соответственно указанному на этикетке ампулы титру. Реакцию проводят чаще всего в объеме 2,5 мл, поэтому к 0,5 мл разведенной 1: 5 испытуемой сыворотки добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл разведенного антигена. Остальные 1,5 мл составляют 1 мл гемолитической системы и 0,5 мл комплемента.
Реакцию считают положительной при наличии выраженной в разной степени задержки гемолиза в испытуемой сыворотке. В контроле (сыворотка крови здоровых людей) наблюдается полный гемолиз.
121. Реакция Вассермана
В сыворотке крови больных сифилисом находятся реагины и антитела. Реагины обладают свойством вступать в соединения с кардиолипиновым антигеном. Специфические антитела против бледной трепонемы вступают в соединение со специфическими антигенами. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело сорбируют добавляемым в реакцию комплементом. Индикацию производят путем введения гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка).
Для проведения реакции требуются:
а) изотонический раствор натрия хлорида;
б) ультраозвученный трепонемный (хранят в холодильнике при температуре +4 °С) и кардиолипиновый (хранят при комнатной температуре) антигены;
в) комплемент, представляющий собой сыворотку крови, полученной при пункции сердца 5-10 здоровых гвинейских свинок. Может сохраняться в холодильнике в течение 2 мес при условии
консервирования 4 % раствором борной кислоты и 5 % раствором натрия Сульфата;
г) гемолизин - гемолитическая сыворотка крови кролика, иммунизированная эритроцитами барана с разными титрами (хранят в холодильнике при температуре 4 °С);
д) эритроциты барана, получаемые пункцией яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными шариками (для перемешивания), встряхивают 15 мин. Сгустки фибрина отделяют фильтрованием через стерильную марлю. Дефибринированную кровь можно хранить в холодильнике до 5 сут.
Иногда возникает необходимость более длительного хранения крови барана, в связи с чем ее консервируют специальным консервантом (6 г глюкозы, 4,5 г кислоты борной, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида), который кипятят на водяной бане по 20 мин в день в течение 3 сут. На 100 мл дефибринированной крови барана требуется 15 мл консерванта. Консервированную таким образом дефибринированную кровь хранят в холодильнике.
Проведению основного опыта предшествует несколько этапов.
У больного из локтевой вены берут 5-10 мл крови и обрабатывают сыворотку. У детей кровь можно взять из височной вены или разреза на пятке. Пункцию делают стерильными инструментами, шприц и иглу
предварительно промывают изотоническим раствором натрия хлорида.
Кровь для исследования берут натощак; за 3-4 дня до исследования больному запрещают употреблять наркотические средства, препараты наперстянки, принимать алкоголь.
Не следует проводить исследование у больных с повышенной температурой тела, после травмы, операции, наркоза, перенесенных недавно инфекционных заболеваний, у женщин во время менструации, у беременных (в последние 10 дней беременности), рожениц (в первые 10 дней после родов), а также новорожденных (в первые 10 дней жизни).
Полученную кровь в стерильной пробирке помещают на 15-30 мин в термостат при температуре 37 °С. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стерильной стеклянной палочкой и ставят в холодильник на сутки. Отделившуюся прозрачную сыворотку (над сгустком) отсасывают пастеровской пипеткой с помощью резиновой груши либо осторожно сливают в другую стерильную пробирку и инактивируют на водяной бане в течение 30 мин при температуре 56 °С. Приготовленную таким образом для опыта сыворотку можно хранить в холодильнике до 5-6 дней.
Антигены разводят соответственно способу и титру, указанным на этикетке.
Приготавливают гемолитическую систему. Для этого дефибринированную кровь или эритроциты барана в количестве, необходимом для проведения реакции, центрифугируют, плазму осторожно отделяют, а осадок промывают 5-6 объемами изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет совершенно бесцветной. Из осадка готовят 3 % взвесь эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру.
Раствор гемолитической сыворотки и взвесь эритроцитов барана быстро смешивают и помещают в термостат на 30 мин.
Сухой комплемент разводят изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:10, нормальную инактивированную сыворотку человека- 1:5.
Комплемент титруют в 30 пробирках, помещенных в штатив по 10 пробирок в 3 ряда. В двух рядах его титруют в присутствии двух антигенов, в третьем - с изотоническим раствором натрия хлорида. Пять пробирок являются контрольными: две для соответствующих двух антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность; заполняют их следующим образом:
Реактивы, мл | Ряд пробирок |
||||
3 % взвесь эритроцитов барана | |||||
Гемолитическая сыворотка, разведенная по утроенному титру | |||||
Комплемент 1:10 | |||||
Трипонемный антиген, разведённый по титру | |||||
Кардиолипиновый антиген, разведённый по титру | |||||
Изотонический раствор натрия хлоприда |
Пробирки помещают на 45 мин в термостат, после чего их проверяют. Гемолиза не должно быть ни в одной пробирке.
Комплемент в разведении 1:10 разливают в 10 пробирок 1-го ряда штатива в дозах: 0,1, 0,16, 0,2,0,24, 0,3, 0,36,0,4,0,44, 0,5 и 0,55 мл. К содержимому каждой пробирки добавляют изотонический раствор натрия хлорида до 1 мл и тщательно перемешивают. По 0,25 мл смеси из каждой пробирки переносят в соответствующие пробирки 2-го и 3-го рядов. Штатив с пробирками встряхивают, в 3-й ряд пробирок добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, вновь встряхивают и помещают на 45 мин в термостат при температуре 37 °С. Нормальную сыворотку крови человека, разведенную изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:5, по 0,25 мл разливают во все 30 пробирок.
Антиген I (трепонемный ультраозвученный), разведенный по титру изотоническим раствором натрия хлорида, по 0,25 мл добавляют в 10 пробирок 1-го ряда; антиген II (кардиолипиновый в том же разведении и в том же количестве) - в 10 пробирок 2-го ряда. В 10 пробирок 3-го ряда приливают по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида, оставшиеся 0,25 мл выливают. После инкубации в термостате в 20 пробирок (1-го и 2-го ряда) добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и повторно помещают в термостат на 45 мин.
Через 45 мин определяют рабочую дозу комплемента, то есть титр его с надбавкой в пределах 15-20 %.
Титром комплемента считают его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов барана в присутствии антигена и нормальной сыворотки крови человека.
Основной опыт заключается в том, что каждую испытуемую инактивированную сыворотку, разведенную в пропорции 1: 5 изотоническим раствором натрия хлорида, разливают по 0,25 мл в три пробирки. В первую пробирку добавляют 0,25 мл антигена I, во вторую - 0,25 мл антигена II, в третью (контроль) -0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Во все пробирки добавляют также по 0,25 мл разведенного до рабочей дозы комплемента. Все пробирки помещают на 45 мин в термостат, затем в них добавляют по 0,5 мл гемолитической системы, встряхивают и ставят в термостат на 45-50 мин. Результат опыта регистрируют после наступления полного гемолиза в контрольных пробирках.
Результаты реакции оценивают плюсами: полная задержка гемолиза (резкоположительная реакция) ++++, значительная (положительная реакция) +++, частичная (слабоположительная реакция) ++, незначительная (сомнительная реакция) - ±, отсутствие задержки гемолиза (отрицательная реакция) -.
При количественном методе проведения реакции Вассермана опыт ставят с уменьшающимися объемами сыворотки, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида.
Схема проведения основного опыта реакции Вассермана
Ингредиенты (в мл). Общий объем 1,25 мл | № пробирок |
||
Испытуемая сыворотка инактивированная, разведенная в пропорции 1: 5 Антиген I (трепонемный), разведенный по титру Антиген II (кардиолипиновый), разведенный по титру Изотонический раствор натрия хлорида Комплемент, разведенный по рабочей дозе | |||
Клиническое значение реакции Вассермана трудно переоценить. Ее проводят всем больным до начала лечения, но особое значение она имеет при скрытом сифилисе, поражении внутренних органов и нервной системы.
Результаты реакции Вассермана характеризуют качество проведенного лечения, что дает основание в определенные сроки снимать с учета лечившихся больных.
При первичном сифилисе реакция Вассермана положительная обычно в конце 6-й недели с момента заражения; при вторичном свежем сифилисе она положительная почти в 100 % случаев, при вторичном рецидивном -в 98-100%; третичном активном - в 85%; третичном скрытом - в 60 % случаев.
Реакцию Вассермана проводят двукратно всем беременным, больным с соматическими, нервными, психическими и кожными болезнями, а также декретируемым контингентам населения. В то же время к.положительным и слабоположительным результатам реакции следует относиться критически, так как они могут быть в конце беременности и после родов, при гипертиреозе, малярии, проказе, распаде злокачественной опухоли, инфекционных заболеваниях, коллагенозах и др. Поэтому при наличии клинических проявлений болезни их следует учитывать, наряду с данными бактериоскопии, в первую очередь.
Вместе с тем имеются факторы, которые могут исказить истинный характер полученных результатов реакции Вассермана: плохо вымытая лабораторная посуда (следы кислоты и щелочи в пробирках), длительное хранение крови, взятой для исследования, употребление больными жиров и алкоголя перед обследованием, период менструации и др.
Во всех случаях желательно проводить комплексное обследование больного, включающее, помимо реакции Вассермана, также РИБТ (см. 122, 123, 124) и др.
122. Реакция Закса - Витебского (цитохолевая)
Применяется для выявления сифилиса. Основана на образовании осадка при смешивании сыворотки крови больного с антигеном.
Для приготовления антигена мышцы нескольких бычьих сердец очищают от сухожилий, фасций, жира, измельчают на мясорубке и экстрагируют 5-кратным объемом 96 % этилового спирта в течение 15 дней при ежедневном 20-минутном встряхивании. Полученный экстракт выпаривают на водяной бане в фарфоровой чашке под вакуумом. К остатку (ярко-желтой массе липоидов) добавляют горячий 96 % этиловый спирт в количестве 1/3 объема взятых для экстрагирования мышц.
Экстракт держат 3 дня при комнатной температуре, фильтруют (в холодной воде) и добавляют 0,3-0,6 % раствор кристаллического холестерина в зависимости of результатов титрования положительными и отрицательными сыворотками. Хранят цитохолевый антиген при комнатной температуре в запаянных ампулах либо закупоренных пробирках.
Методика. К 2 мл изотонического раствора натрия хлорида быстро приливают 1 мл цитохолевого антигена и оставляют при комнатной температуре на 15 мин до появления хлопьев. В пробирку к 0,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,1 мл антигенной эмульсии, встряхивают в течение 3 мин и оставляют в покое на 30 мин, после чего добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида.
В контрольную пробирку с антигеном добавляют 1,2 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл антигенной эмульсии. В контроле хлопьев не должно быть. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью лупы и обозначают в зависимости от количества выпавших хлопьев плюсами (++++, +++, ++). При отрицательной реакции хлопьев нет, но содержимое пробирки может слегка опалесцировать.
В 1931 г. П. Sachs и Е. Witebsky предложили модификацию данной методики, заключающуюся в том, что антиген разводят двухфазно: к 1 части антигена добавляют 2 части изотонического раствора натрия хлорида, выдерживают при комнатной температуре 5 мин и добавляют еще 9 частей изотонического раствора натрия хлорида. Рекомендовано также разводить антиген 2 % раствором натрия хлорида, что, по мнению авторов, повышает чувствительность реакции. Возможна и количественная модификация реакции с разведением сыворотки (1:4, 1:8, 1: 16, 1:32, 1: 64 и т. д.).
Реакция достаточно чувствительна, занимает мало времени (около 1 ч), результаты ее читаются сразу.
123. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)
С помощью реакции в сыворотке крови больных сифилисом выявляют антитела и комплемент, обездвиживающие бледную трепонему.
При первичном сифилисе РИБТ преимущественно отрицательная, при вторичном - положительная в 92-96 % случаев, при третичном - в 92-100 %,при сифилисе нервной системы и врожденном - в 86-89 % случаев.
Положительные результаты РИБТ отмечены при саркоиде, эритематозе, диабете, злокачественных опухолях, вирусном гепатите, циррозе печени, малярии, лепре, инфекционном мононуклеозе, некоторых болезнях жарких стран (пинта, фрамбезия и др.).
Антигеном служит взвесь бледных трепонем, взятых из яичек кролика, зараженного сифилисом путем введения в яичко 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем в изотоническом растворе натрия хлорида (50 особей в поле зрения).
Материал из яичка следует брать через 6-8 дней после заражения животного. Перед взятием антигена кролика забивают методом обескровливания (пункция сердца или сонной артерии). Ткань яичка измельчают и заливают сывороткой крови здорового кролика, разведенной изотоническим раствором натрия хлорида, встряхивают в течение -30 мин, а затем 10 мин центрифугируют (1000 оборотов в 1 мин). Надосадочную жидкость микроскопируют. В каждом поле зрения должно быть не менее 10-15 бледных трепонем.
Комплемент готовят обычным способом из крови гвинейских свинок.
Для проведения РИБТ необходимы: 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина, 1,6 мл взвеси бледных трепонем; рН среды - 7,2. К указанной смеси прибавляют 0,15 мл комплемента (коктейль). Параллельно ставят две пробы: с активным (опыт) и реактивным (контроль) комплементами.
В меланжеры до отметки «1» набирают исследуемую сыворотку, а затем до отметки «2» - коктейль и закрывают их стерильным резиновым кольцом.
Одновременно аналогичную реакцию проводят с заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотками.
Меланжеры нумеруют и ставят в термостат при температуре 35 °С на 18-20 ч, после чего попарно (опыт - контроль) извлекают их из термостата и содержимое выливают в соответствующие пробирки. На предметное стекло наносят 2 капли: слева - опыт, справа - контроль, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в темном поле зрения.
Вначале изучают результаты контроля: определяют процент подвижных и неподвижных бледных трепонем. Формула подсчета: X = (А - В)/А * 100, где А - количество подвижных бледных трепонем в контроле; В - количество подвижных бледных трепонем в опыте.
Пример: (24 - 19) / 24 * 100 = 21 %.
Оценки результатов РИБТ: ниже 20 % - отрицательный. 21-30 % - сомнительный, 31-50 % - слабоположительный, свыше 50 % -положительный.
Диагностические лабораторные исследования в психиатрии направлены на оценку соматического состояния больного, контроль за ним в процессе лечения, а также на выявление соматических заболеваний, обуславливающих психические расстройства. Большинство применяемых в психиатрии лабораторных методов не отличаются от таковых общесоматической медицины. Однако существует ряд специфических методов, с помощью которых можно с большой точностью поставить этиологический диагноз "в пробирке". К ним относятся коллоидные реакции, применяемые для диагностики сифилиса, выявление нарушений обмена аминокислот при олигофрениях, установление содержания наркотических средств в биологических средах, а также определение уровня психотропных препаратов в крови для контроля лечения.
I. Определение содержания психоактивных веществ в моче.
Применяется с целью установления факта однократного приема психоактивных веществ, а при повторных определениях – для установления злоупотребления ими и наличия у пациента зависимости. Сроки, в течение которых эти вещества могут быть обнаружены после последнего приема колеблются от нескольких часов до месяца. Ориентировочное время, в течение которого препарат можно обнаружить в моче приведено в таблице:
Вещества |
Время |
Алкоголь | |
Барбитураты |
24 ч (непролонгированного действия) 3 нед (пролонгированного действия) |
Бензодиазепины | |
6-8 ч (метаболиты – 2-4 дня) |
|
Марихуана |
3 дня – 4 нед (зависит от частоты использования) |
Метаквалон | |
Фенилциклидин | |
Пропоксифен | |
II. Основные реакции спинномозговой жидкости.
Реакция Панди
Методика определения основана на определении степени помутнения СМЖ при добавлении ее к 15% раствору карболовой кислоты. На предметное стекло наносят несколько капель реактива Панди и рядом 1-2 капли ликвора. При их смешении появляется помутнение различной степени выраженности (в зависимости от количества содержащегося в СМЖ белка). Результат определяется на темном фоне через 2 мин. Степень помутнения обозначается плюсами (+, ++, +++, ++++) или (по системе СИ) цифрами (1,2,3).
Диагностическое значение. Дает общее представление о содержании белка в ликворе, не являясь специфической глобулиновой пробой.
Реакция Нонне-Аппельта.
Методика определения основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором сернокислого аммония. В пробирку, содержащую 0,5-1,0 мл реактива наслаивают равное количество СМЖ. Через 2 мин на границе растворов появляется белое кольцо. Затем пробирку встряхивают и определяют степень помутнения, выражая ее плюсами. Помутнение появляется уже при содержании белка 0,033 г/л.
Диагностическое значение. Дает относительное представление о нормальном или патологическом содержании глобулинов, количество которых особенно увеличивается при дегенеративных и хронических воспалительных заболеваниях.
Реакция Ланге (с коллоидным золотом)
Методика определения. При добавлении патологического ликвора к высокодисперсному коллоидному раствору хлорного золота происходит коагуляция, осаждение частиц и изменения цвета раствора. В каждую из десяти пробирок, содержащих СМЖ в различных разведениях (1:10, 1:20, 1:40 и т.д.), прибавляют по 2,5 мл коллоидного раствора. Результат наблюдают спустя сутки. При нормальном ликворе цвет раствора остается красным во всех пробирках (возможно лишь небольшое снижение его интенсивности в 3-5-й пробирках). При патологических состояниях цвет меняется, изменение цвета оценивается цифрами 0 – красный, 1 – красно-фиолетовый, 2 – фиолетовый, 3 – сине-фиолетовый, 4 – синий, 5 – голубой, 6 – белый.
Диагностическое значение. Различают нормальный, дегенеративный (изменение цвета в левой половине ряда – наблюдается при сифилисе, опухолях, рассеянном склерозе), воспалительный (изменение цвета в правой половине ряда – наблюдается при менингитах) и смешанный типы кривых (изменение цвета в левой и средней частях ряда наблюдается при смешанных менинго-паренхиматозных поражениях).
Основные физические и химические показатели люмбальной СМЖ: бесцветная, прозрачная, рН = 7,4-7,6, общий белок – 0,22-0,33 г/л, альбумины – 46,6-52,8‰, глобулины – 53,4-47,2‰, фибриноген – 0,0019-0,0030 г/л, мочевина – 1,0-3,3 ммоль/л, глюкоза – 2,5-4,44 ммоль/л, холестерин – 0,002-0,011 ммоль/л, общий азот – 11,4-15,7 ммоль/л, остаточный азот – 8,6-13,6 ммоль/л.
III . Определение содержания психотропных препаратов в плазме. Имеет практический смысл в тех случаях, где существует близкая к линейной зависимость между содержанием препарата в плазме в лечебным эффектом и где известно «терапевтическое окно», то есть тот диапазон концентраций, при котором препарат оказывает наибольший терапевтический эффект. Используется для препаратов лития и некоторых трициклических антидепрессантов в терапии расстройств настроения.
Определение содержания лития: кровь берется через 12 часов после последнего приема препарата внутрь (обычно утром после вечернего приема); частота определений в начале лечения – 1-2 раза в неделю, после установления дозы – 1 раз в месяц. Для поддерживающей терапии биполярного аффективного расстройства необходима концентрация 0,6-1,0 мг-экв/л, для купирования маниакальных состояний – 1,0-1,5 мг-экв/л.
Трициклические антидепрессанты: «терапевтическое окно» для имипрамина (мелипрамина) – 200-250 нг/мл, триптизола (амитриптилина) – 120-250, нортриптилина – 50-150, дезипрамина (петилила) – 125-250 нг/мл.
… параллельно с ростом общей заболеваемости сифилисом отмечается увеличение доли случаев нейросифилиса .Согласно инструкции по лечению и профилактике сифилиса, исследование спинномозговой жидкости необходимо проводить до лечения у больных ранним и поздним скрытым сифилисом при наличии клинических поражений нервной системы, а также при скрытых и поздних формах нейросифилиса.
Ликворологические обследования при снятии с учета проводятся :
(1 ) пациентам, лечение которых было начато по поводу раннего и позднего нейросифилиса;
(2 ) лицам, у которых в процессе клинико-серологического контроля появились какие-либо клинические проявления специфического поражения нервной системы (острый сифилитический менингит, менинговаскулярный сифилис, сифилитический менингомиелит, спинная сухотка (tabes dorsalis), сифилитическая гумма, сифилитические невриты и полиневриты, сифилитическое поражение зрительных нервов, сифилитическое поражение слуховых нервов, сифилитический менингомиелит, прогрессивный паралич);
(3 ) лицам с серологической резистентностью, сохраняющейся к концу срока клинико-серологического наблюдения.
Спинномозговую жидкость для исследования получают путем поясничного прокола между III и IV или IV и V поясничными позвонками при помощи длинных тонких пункционных игл (диаметром от 0,4 до 0,8 мм и длиной 10-12 см). Ликвор по 3-4 мл собирают в две стерильные пробирки (не более 8-10 мл). Необходимо следить, чтобы жидкость вытекла и канюли каплями (20-40 капель в минуту). Если жидкость после извлечения мандрена из иглы вытекает струей, то надо незамедлительно ввести мандрен обратно на небольшую глубину с целью регулировки скорости вытекания жидкости.
Если первые капли ликвора окрашены кровью, следует изменить положение иглы (продвинуть глубже или слегка вытянуть). Затем прозрачную жидкость собирают в другую пробирку (порция ликвора с примесью крови не исследуется).
После пункции место прокола обрабатывается 3-5%-ной йодной настойкой и накладывают стерильную повязку. Чтобы предупредить осложнения, больного укладывают на кровать животом вниз (ножной конец кровати приподнимают на 20-30 см). Спустя 3-4 часа ему разрешается повернуться набок. Постельный режим соблюдается 24-48 часов. Больному рекомендуется обильное питье и голод в течение 6-8 часов после пункции.
Одну порцию спинномозговой жидкости (3-4 мл) направляют в клинико-биохимическую лабораторию для исследования цитоза, содержания белка, постановки глобулиновых (Панди, Нонне-Аппельта, Вейхбродта или Таката-Ара) и коллоидных (Ланге или парафиновой) реакций.
Реакция Нонне-Апельта . С помощью насыщенного раствора сульфата аммония на границе соприкосновения реактива со спинномозговой жидкостью образуется белковое кольцо. После стряхивания, а следовательно, смешения жидкостей получается опалесценция или помутнение различной интенсивности. Реакцию Нонне-Апельта оценивают по четырехбалльной системе: слабо положительная (+) - опалесценция слабо заметна, умеренно положительная (++) - незначительное помутнение, положительная (+++) - выраженное помутнение и резко положительная (++++) - интенсивное помутнение. Росс-Джонс несколько модифицировал эту реакцию. Он предложил не смешивать спинномозговую жидкость с насыщенным раствором сульфата аммония, а осторожно сверху наливать ее из пипетки каплями на более концентрированный реактив. Причем спинномозговая жидкость готовится в различных степенях разведения. Через 3 мин определяется степень помутнения кольца, образовавшегося на границе жидкостей и раствора сульфата аммония. Кольцо опалесценции образуется при содержании белка в спинномозговой жидкости в концентрации 3 г/л.
Реакция Панди осаждает не только глобулины, но и все белки спинномозговой жидкости. Заключается в том, что на часовое стеклышко, которое ставится на темном фоне, наносят 10-15 капель 10 % раствора карболовой кислоты, затем одну каплю спинномозговой жидкости. Реакция отличается высокой чувствительностью и определяется по интенсивности помутнения, образовавшегося на месте соприкосновения жидкости и реактива, по истечении 3 мин.
Реакция Вайнброхта производится таким образом, что к 7 частям спинномозговой жидкости прибавляют 3 части 0,1 % раствора серебра нитрата, а затем встряхивают. При этом наступает различной степени помутнение, по которому судят о содержании белковых веществ (не только глобулинов).
Таката-Ара реакция . Коллоидная реакция. При добавлении к подщелоченному ликвору растворов сулемы и фуксина в норме наблюдается смесь фиолетового цвета. При просветлении жидкости и выпадении осадка реакцию обозначают как метасифилитическую (прогрессивный паралич), при окрашивании в красный цвет - как менингитическую.
Реакция Ланге основана на способности патологически измененного ликвора при смешении его с коллоидными растворами менять дисперсность раствора и тем самым его цвет; при нормальном ликворе пурпурно-красный цвет раствора не меняется. При патологии различают несколько типов кривой изменения цвета. Первый тип - паралитический: при постепенно повышающихся степенях расщепления ликвора в пробирках обесцвечивание происходит только в первых 5 пробирках с довольно крутым возвращением к норме. Такой ход реакции свойствен прогрессивному параличу. Для других форм нейросифилиса более характерен сифилитический зубец - умеренное изменение цвета во 2-5-й пробирке. Второй тип кривой - менингитический (острые менингиты): изменение цвета отмечается со 2-3-й пробирки, достигает максимума в 6-й и 7-й пробирках, после чего круто возвращается к норме. При других заболеваниях центральной нервной системы реакция Ланге является достаточно типичной и не может служить подсобным диагностическим средством.
Вторую порцию ликвора (3-4 мл) отправляют в серологическую лабораторию для проведения реакции Вассермана с кардиолипиновым и трепонемным антигенами, РИФ и РИБТ.
Реакция Вассермана (реакция связывания комплемента, РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами применяются для подтверждения диагноза сифилиса при наличии активных проявлений болезни, для обследования лиц, бывших в пловом контакте с больным сифилисом, выявления латентного (скрытого) сифилиса, эффективности проводимой терапии. При обследовании больных психиатрических и неврологических стационаров. Доноров и беременных, включая лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.
Кровь для исследования берут в количестве 5-7 мл из локтевой вены стерильной иглой. У грудных детей кровь берут из височной вены или из надрезов на пятке. Взятие крови производят строго натощак. И оставляют ее в чистых сухих пробирках на 2-3 ч при комнатной температуре для свертывания. Постановку КСР и специфических реакций производят в серологических лабораториях кожно-венерологических учреждений.
Принцип РСК заключается в том, что реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединения с различными антигенами. Образовавшиеся комплексы сортируют введенный в реакцию комплемент. Для индикации комплекса реагины–антиген–комплемент используется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). При наличии комплекса эритроциты выпадают в осадок. Что заметно не вооруженынм глазом. Выраженность гемолиза обозначается врачом ключами: резко положительная 4+, положительная 3+, слабоположительная 2+ ли 1+ и отрицательная. Кроме качественной оценки этих реакций имеется и количественная, имеющая значение в диагностике некоторых стадий сифилиса и при контроле за эффективностью терапии.
В настоящее время в качестве антигенов рекомендовано применять кордилипиловый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трипонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь апатогенных культуральных трепонем). Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым и трепонемным антигенами становится положительной через 2-4 недели постепенно нарастает и достигает максимума (1:160 – 1:320 и выше) при вторичном свежем сифилисе. Затем титр реагинов постепенно падает и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:180 - 1:120. среди больных с третичным сифилисом указанные реакции дают положительный результат только у 70%.
Следует подчеркнуть, что КСР не являются строго специфичным для сифилиса и в ряде случае в может давать ложноположительные (неспецифические) результаты, они могут получаться в связи с техническими ошибками (полный гемолиз, нестерильное взятие крови, недостаточная квалификация лаборантов). Ложные реакции наблюдаются у больных лепрой, малярии, иногда с ситуационными заболеваниями, новообразованиями, туберкуле, заболеваниями печени, при приеме лекарственных препаратов, а также во время беременности. При менструациях и т.д. Не рекомендуется исследовать кровь в течение первой недели после вакцинации, травм, хирургических вмешательств, при лихорадочных состояниях в течение первых 2 –х недель после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни, т.к. физико- химические изменения в сыворотке крови при этих состояниях могут быть сходы с теми, которые наблюдаются у больных сифилисом.
РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном в этой реакции служит взвесь убитых культурных бледных трепонем, фиксированная к предметным стеклам на которые наносят исследуемую и антивидовую флюоресцирующую сыворотки. Результаты РИФ определяют под люминесцентным микроскопом путем оценки свечения трепонем в препарате. При положительном результате трепонемы имеют желтовато-зеленое свечение, степень которого, обозначают плюсами от 1+ до 4+, при отрицательных результатах трепонемы не светятся. РИФ в настоящее время ставят в нескольких модификациях (РИФ – abs, РИФ– 200).
РИБТ , предложенная в 1949 г.Р. Нельсоном и М. Мейером, основана на феномене обездвиживания бледных трепонем антигенами сыворотки крови больного в присутствии комплемента. В качестве антигена для РИБТ используют взвесь бледных живых трепонем, полученных от зараженных сифилисом кроликов. Подсчет утративших подвижность (иммобилизированных) трепонем ведут под микроскопом. Результаты реакций оценивают в процентах от 0 до 20% – отрицательный, от 21 до 31% - сомнительная, от 31 до 50% - слабоположительная, от 51 до 100% - положительная. РИБТ становится положительным в конце первичного периода сифилис а и остается таковой в течениие всех периодов этого заболевания, а иногда и после полноценного противосифилического лечения. РИБТ может давать ложноположительные результаты, если в исследуемой сыворотке содержаться трепонемоционные вещества (антибиотики – пенициллин, тетрациклин), вызывающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем. Поэтому нельзя исследовать кровь на эту реакцию ранее 2 недель после окончания прима антибиотиков.
Для проведения специфических серологических реакций (РИФ и РИБТ) кровь берут из локтевой вены натощак в количестве 5-10 мл. Шприц и иглу после стерилизации промывают изотоническим раствором хлорида натрия, и кровь вливают в сухую пробирку для исследования на РИФ и в стерильную пробирку для исследования на РИБТ. Постановка специфических серологических реакций на сифилис производится в специализированных лабораториях кожно- венерологических учреждений.
Результаты ликворологического исследования оцениваются по шкале Робустова , дополненной последними данными о РИФ и РИБТ со спинномозговой жидкостью. Согласно этой классификации, различают четыре степени изменений спинномозговой жидкости у больных сифилисом.
I степень – незначительные изолированные или комбинированные изменения спинномозговой жидкости.
Изменения спинномозговой жидкости считаются незначительными, когда определяются: цитоз более 8 клеток в 1 мм3 , белок свыше 0,33%, реакции Нонне-Апельта (++), реакция Панди (+++), реакция Ланге больше двоек или одна тройка, РВ слабоположительна, РИФ положительна.
Если обнаруживается одно из таких изменений, говорят об изолированных изменениях ликвора, если же два – о комбинированных. чаще всего они выявляются до лечения у больных первичным и вторичным сифилисом, сосудистым нейросифилисом, у некоторых больных, недавно закончивших лечение нейросифилиса, а также у отдельных обследуемых после контрольного срока наблюдения.
II степень – значительные изменения ликвора при отрицательных результатах РВ и РИБТ.
Отмечается белково-клеточная диссоциация (цитоз в пределах нормы или слегка повышен, количество белка резко повышено, глобулиновые коллоидные реакции положительны) или клеточно-белковая (плеоцитоз и незначительное повышение белка, реакция Панди и Нонне-Аппельта слабоположительны или отрицательны).
Такие изменения чаще обнаруживаются у больных различными клиническими формами сифилитического менингита, менинговаскулярным сифилисом.
III степень – резкие изменения спинномозговой жидкости (клеточно-белковая или белково-клеточная диссоциация, глобулиновые реакции чаще положительны) и положительные результаты РВ, РИБТ и РИФ.
Определяется у больных запущенным ранним скрытым или острым ранним сифилитическим менингитом, менинго-васкулярным сифилисом, поздним мезенхимальным нейросифилисом и у некоторых больных спинной сухоткой.
IV степень – паралитичсекий тип изменений спинномозговой жидкости: высокий плеоцитоз или большое содержание белка, глобулиновые реакции, РВ, РИФ, РИБТ положительны, кривая Ланге паралитичсекого типа.
Такие изменения ликвора наиболее характерны для больных прогрессивным параличом, табопараличом, в меньшей степени – для больных спинной сухоткой и в еще меньшей степени – для больных поздним мезенхимальным нейросифилисом.
К. Панди - венгерский психиатр и невропатолог, исследовавший спинно-мозговую жидкость. Он выявил что при контакте раствора карболовой кислоты и ликвора образуется помутнение, степень которого зависит от количества глобулинов в ликворе, что и сделало его автором реакции Панди.
Реакция Панди — это
неспецифическая проба для ориентировочного определения уровня всех белков (альбуминов и глобулинов) в ликворе.
В отличие от реакции Нонне-Апельта преакция Панди оценивает количество всех белков в ликворе, а не только глобулинов.
Реакция Панди заключается в реакции белков ликвора с насыщенным раствором карболовой кислоты, в результате белки денаруруют (сворачиваются в большие комочки) и выпадают в осадок, что можно оценить невооруженным глазом. На часовое стекло, положенное на черную бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю наносят 1-2 капли ликвора.
В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с используемым ликвором образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть.
Расшифровка
Для обозначения результатов реакции Панди пользуются системой 4 плюсов:
1. слабая - +
2. заметная опалесценция - ++
3. умеренное помутнение -+++
4. значительное помутнение -++++
Заболевания с положительной реакцией Панди:
- гнойный менингит
- после операций на головном и спинном мозге
- опухоли
- травмы мозга с кровоизлиянием
- сифилитическое поражение центральной нервной системы
- туберкулезный менингит
- прогрессивный паралич
- рассеянный склероз